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饲料中三聚氰胺的测定
日期：2024-09-29 18:38
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摘要：
饲料中三聚氰胺的测定
1 范围
本标准规定了用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱质谱法（GCMS）测定饲料中三聚氰胺的方法。高效液相色谱法为筛选法，气相色谱质谱法为确证法。
本标准适用于配合饲料，预混料、浓缩饲料、饲料添加剂、植物性蛋白粉、宠物饲料中三聚氰胺的测定，方法*低定量限高效液相色谱法和气相色谱质谱法分别为2.0mg/kg和0.05mg/kg，高效液相色谱的*低检测浓度分别为0.5mg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本适用于本标准。
**法 高效液相色谱法
3 原理
试样中的三聚氰胺用1％三***提取，离心后取部分提取液，用阳离子交换柱净化，洗脱物用具有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行定量。
4 试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682**用水的规定。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 乙睛：色谱纯。
4.3 氨水。
4.3 阳离子交换柱(SPE柱)：60mg，3mL或150mg，6mL。
4.4 1％三***：称取10g三***溶解于1000mL水中。
4.5 5％氨化甲醇：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中。
4.6乙酸铅溶液（ρ（PbAc2）=22g/L）：取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L。
4.7 m，有机相m滤膜：0.45
4.8 三聚氰胺标准品（﹥99.0％）
4.9标准储备液（1mg/mL）：称取100mg（**到0.1mg）的标准品，用甲醇/水（2:8，V:V）溶解并定容于100mL容量瓶中。
4.10 标准工作液：标准工作液按照需要逐级稀释配制。
5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。
5.2 离心机：10000rpm
5.3 涡旋混合器
5.4 氮吹仪
5.5 固相萃取装置
5.6 高速匀质器
5.7 索式提取器
6 测定步骤
6.1 提取
6.1.1 植物蛋白和饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，准确加入48ml1％的三***溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.1.2 宠物饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，在索式提取器中用乙醚回流6h去除脂肪。脱脂残渣准确加入48ml1％的三***溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.2 净化
m滤膜，滤液用于液相色谱测定。m MCX柱活化和上样：分别用3ml甲醇，3ml水活化MCX柱，准确移取10mL离心液分次上柱。再用3ml水和3ml甲醇洗涤MCX柱，抽近干后用5％氨化甲醇溶液（4.5）3ml洗脱。洗脱液于氮吹仪上50℃氮吹至干，用2+8甲醇水定容，过0.45
6.3 测定
6.3.1液相色谱条件
m；m4.6mm(i.d)，5´色谱柱：C8柱，150
柱温：室温
流动相：10+90（乙腈：10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）
检测波长：240nm
Lm进样量：20
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，按照保留时间和二极管阵列的紫外光谱进行定性，标准工作液应有五个浓度水平。标准工作液和待测样液中三聚氰胺的响应值应在仪器线性响应范围内。
6.4 结果计算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：
式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品*终定容体积，单位为克（g）；
g/L）；mc－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（
m－试样量，单位为克（g）。
n — 稀释倍数。
6.5 结果表示
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7重复性
在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%
气相色谱－质谱法（确证法）
8 方法提要
试样中的三聚氰胺用1％三***提取，用阳离子交换柱净化，用BSTFA衍生化，用气相色谱-质谱进行定性和定量分析。
9 试剂和材料
衍生化试剂：N,O-双**基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）
其他同5
10 仪器和设备
气相色谱-质谱，其它同6
11 分析步骤
前处理同6.1和6.2
11.1 衍生化
L的BSTFA，混匀，在70℃衍生30min。同时用三聚氰胺标准系列做同步衍生。mL的吡啶和200m将6.2的净化液吹干，加入200
测定
11.2 气相色谱－质谱条件
柱子：DB-5MS柱
载气：He 流速: 1.3 ml/min 平均线性速度: 35 cm/sec 压力: 17.5 psi (initial)模式:恒流
进样：不分流或分流进样 (1:20)，进样体积为1µl，进样温度: 250ºC
升温程序：起始温度为75ºC，持续1.0 min，以30ºC/min升温至300ºC，保持2.0min。传输线温度为280ºC。
运行时间: 10.5 min
质谱条件：质量范围: 40-450 amu
扫描模式：全扫描 (Electron Ionization)
溶剂延迟: 4.2 min (splitless); 3.8 min (split)
四极杆: 150ºC
离子源: 230ºC
监测离子：特征离子 171，99，73；分子离子：327，342
11.3 定性定量方法
定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于0.5%。特征离子基峰百分数与标准品相差不大于20％。
定量方法：选择离子监测（SIM）法计算峰面积，单点或多点校准法定量。
12 结果结算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：
式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品*终定容体积，单位为克（g）；
g/L）；mc－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（
m－试样量，单位为克（g）。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
13 允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两个平行测定的相对偏差不大于20％。
1 范围
本标准规定了用高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱质谱法（GCMS）测定饲料中三聚氰胺的方法。高效液相色谱法为筛选法，气相色谱质谱法为确证法。
本标准适用于配合饲料，预混料、浓缩饲料、饲料添加剂、植物性蛋白粉、宠物饲料中三聚氰胺的测定，方法*低定量限高效液相色谱法和气相色谱质谱法分别为2.0mg/kg和0.05mg/kg，高效液相色谱的*低检测浓度分别为0.5mg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的*新版本。凡是不注日期的引用文件，其*新版本适用于本标准。
**法 高效液相色谱法
3 原理
试样中的三聚氰胺用1％三***提取，离心后取部分提取液，用阳离子交换柱净化，洗脱物用具有二极管阵列检测器的高效液相色谱仪进行定量。
4 试剂与材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682**用水的规定。
4.1 甲醇：色谱纯。
4.2 乙睛：色谱纯。
4.3 氨水。
4.3 阳离子交换柱(SPE柱)：60mg，3mL或150mg，6mL。
4.4 1％三***：称取10g三***溶解于1000mL水中。
4.5 5％氨化甲醇：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中。
4.6乙酸铅溶液（ρ（PbAc2）=22g/L）：取22g乙酸铅用约300mL水溶解后定容至1L。
4.7 m，有机相m滤膜：0.45
4.8 三聚氰胺标准品（﹥99.0％）
4.9标准储备液（1mg/mL）：称取100mg（**到0.1mg）的标准品，用甲醇/水（2:8，V:V）溶解并定容于100mL容量瓶中。
4.10 标准工作液：标准工作液按照需要逐级稀释配制。
5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器。
5.2 离心机：10000rpm
5.3 涡旋混合器
5.4 氮吹仪
5.5 固相萃取装置
5.6 高速匀质器
5.7 索式提取器
6 测定步骤
6.1 提取
6.1.1 植物蛋白和饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，准确加入48ml1％的三***溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.1.2 宠物饲料中三聚氰胺的提取
称取5.0g样品，在索式提取器中用乙醚回流6h去除脂肪。脱脂残渣准确加入48ml1％的三***溶液，加入2mL饱和醋酸铅溶液。摇匀，超声提取20min。取提取液约30mL转入离心管，在10000rpm离心机上离心5min。
6.2 净化
m滤膜，滤液用于液相色谱测定。m MCX柱活化和上样：分别用3ml甲醇，3ml水活化MCX柱，准确移取10mL离心液分次上柱。再用3ml水和3ml甲醇洗涤MCX柱，抽近干后用5％氨化甲醇溶液（4.5）3ml洗脱。洗脱液于氮吹仪上50℃氮吹至干，用2+8甲醇水定容，过0.45
6.3 测定
6.3.1液相色谱条件
m；m4.6mm(i.d)，5´色谱柱：C8柱，150
柱温：室温
流动相：10+90（乙腈：10mM庚烷磺酸钠，10mM柠檬酸缓冲液）
检测波长：240nm
Lm进样量：20
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，按照保留时间和二极管阵列的紫外光谱进行定性，标准工作液应有五个浓度水平。标准工作液和待测样液中三聚氰胺的响应值应在仪器线性响应范围内。
6.4 结果计算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：
式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品*终定容体积，单位为克（g）；
g/L）；mc－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（
m－试样量，单位为克（g）。
n — 稀释倍数。
6.5 结果表示
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
7重复性
在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定的相对偏差不大于10%
气相色谱－质谱法（确证法）
8 方法提要
试样中的三聚氰胺用1％三***提取，用阳离子交换柱净化，用BSTFA衍生化，用气相色谱-质谱进行定性和定量分析。
9 试剂和材料
衍生化试剂：N,O-双**基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）
其他同5
10 仪器和设备
气相色谱-质谱，其它同6
11 分析步骤
前处理同6.1和6.2
11.1 衍生化
L的BSTFA，混匀，在70℃衍生30min。同时用三聚氰胺标准系列做同步衍生。mL的吡啶和200m将6.2的净化液吹干，加入200
测定
11.2 气相色谱－质谱条件
柱子：DB-5MS柱
载气：He 流速: 1.3 ml/min 平均线性速度: 35 cm/sec 压力: 17.5 psi (initial)模式:恒流
进样：不分流或分流进样 (1:20)，进样体积为1µl，进样温度: 250ºC
升温程序：起始温度为75ºC，持续1.0 min，以30ºC/min升温至300ºC，保持2.0min。传输线温度为280ºC。
运行时间: 10.5 min
质谱条件：质量范围: 40-450 amu
扫描模式：全扫描 (Electron Ionization)
溶剂延迟: 4.2 min (splitless); 3.8 min (split)
四极杆: 150ºC
离子源: 230ºC
监测离子：特征离子 171，99，73；分子离子：327，342
11.3 定性定量方法
定性方法：样品与标准品保留时间的相对标准偏差不大于0.5%。特征离子基峰百分数与标准品相差不大于20％。
定量方法：选择离子监测（SIM）法计算峰面积，单点或多点校准法定量。
12 结果结算和表述
按照下式计算试样中三聚氰胺的含量：
式中：
W－试样中三聚氰胺的含量，单位为毫克每公斤（mg/kg）；
V－样品*终定容体积，单位为克（g）；
g/L）；mc－由标准曲线而得的样液中三聚氰胺的含量，单位为微克每升（
m－试样量，单位为克（g）。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
13 允许差
取平行测定结果的算术平均值为测定结果，两个平行测定的相对偏差不大于20％。
